2º ano - aula 52 - NOÇÕES DE BIOTECNOLOGIA

Transgênicos: vilões ou mocinhos?

Melhoramento genético e seleção artificial

Há séculos o homem utiliza a prática de melhoramento genético para aperfeiçoar espécies animais e vegetais de interesse.

Tudo começou quando o homem passou a realizar cruzamentos, seguidos de seleção artificial, das variedades que mais lhe interessavam.

Esse procedimento originou inúmeras raças de animais e variedades vegetais que, hoje, fazem parte de nosso dia-a-dia.

Cavalos e jumentos são cruzados para produzir híbridos – mulas e burros – utilizados para serviços de tração;

o gado leiteiro e o de corte são hoje muito mais produtivos que os de antigamente;

plantas como milho, feijão e soja produzem atualmente grãos de excelente valor nutritivo.

Para preservar as qualidades das inúmeras variedades vegetais obtidas em cruzamentos,

o homem aprendeu a fazer a propagação vegetativa, processo executado principalmente pelo plantio de pedaços de caule (estaquia) ou de enxertos (enxertia) das plantas de boa qualidade.

Esse tipo de reprodução assexuada forma clones das plantas com melhores características.

Bons exemplos desse processo são a estaquia, atualmente praticada pelo Instituto Florestal de São Paulo, de pedaços de galho de eucalipto na propagação de variedades produtoras de madeira de excelente qualidade para a construção de casas, e a enxertia de inúmeras variedades de laranja, entre elas a laranja-da-baía, também conhecida como laranja-de-umbigo.

Vimos que, desde os tempos antigos, o homem aprendeu, por meio da observação e da experimentação, a praticar o melhoramento de espécies animais e vegetais que apresentam algum interesse econômico, alimentar ou medicinal.

Essas bases deram início a uma tecnologia conhecida como biotecnologia, que pode ser definida como um conjunto de técnicas que utilizam organismos vivos ou partes deles para a produção de produtos ou processos para usos específicos.

Analisando a definição, podemos pensar que a biotecnologia já é praticada pelo homem a milhares de anos, quando ele aprendeu a utilizar, por exemplo, microorganismos fermentadores para a produção de pães, iogurtes e vinhos.

Depois do conhecimento da estrutura do DNA, na década de 1950, e do entendimento do seu processo de duplicação e da sua participação na produção de proteínas,

surgiu uma vertente da biotecnologia conhecida como engenharia genética, que, por meio de técnicas de manipulação do DNA, permite a seleção e modificação de organismos vivos, com a finalidade de obter produtos úteis ao homem e ao meio ambiente.



A manipulação dos genes

Com a elucidação da estrutura da molécula de DNA por Watson e Crick, em 1953,

e o reconhecimento de que ela era o principal constituinte dos genes,

o grande desafio para os cientistas consistia em fazer uma análise detalhada da sua composição nos diversos seres vivos.

Sabia-se, também, que as bases nitrogenadas adenina, timina, citosina e guanina, componentes dos nucleotídeos,

guardavam relação com o processo do código genético que comandava a produção de proteínas.

Mas, várias dúvidas ainda perturbavam os cientistas: onde começa e onde termina um gene?

Qual a sua seqüência de nucleotídeos?

Quantos genes existem em cada espécie de ser vivo?

A procura por respostas a essas perguntas gerou um intenso trabalho de pesquisa e originou um dos ramos mais promissores e espetaculares da biologia atual: a engenharia genética.

A manipulação dos genes decorrente das pesquisas, conduziu à necessidade de compreender o significado de novos conceitos relacionados a essa área.

Entre esses conceitos estão os de enzima de restrição, sítios alvo, eletroforese em gel, tecnologia do DNA recombinante, técnica do PCR, biblioteca de DNA, sondas, fingerprint etc.








Uma pergunta que você poderia fazer é: porque devo conhecer todos esses conceitos e qual a utilidade deles para a minha vida?



Porque para você ter uma opinião sobre transgênicos, pesquisa de paternidade, produção de medicamentos e vacinas e terapia gênica, deve saber sobre o que está falando.

Todos nós esperamos que as pesquisas contribuam para a melhoria do bem estar da humanidade e por isso temos que conhecer a principais técnica utilizadas por ela para poder julgá-las justamente.

Veja algumas das técnicas utilizadas pela biotecnologia

Enzimas de restrição: As tesouras moleculares

A partir da década de 1970, ficou mais fácil analisar a molécula de DNA com o isolamento da enzimas de restrição.

Estas enzimas são endonucleases, ou seja, no interior (daí o prefixo endo- dentro) das moléculas de DNA, cortando-as em locais bem definidos.

São enzimas produzidas normalmente por bactérias e que possuem a propriedade de defendê-las de vírus invasores.

Essas substâncias “picotam” a molécula de DNA sempre em determinados pontos,

levando a produção de fragmentos contendo pontas adesivas,

que podem se ligar a outras pontas de moléculas de DNA que tenham sido cortadas com a mesma enzima.

Em Engenharia Genética, a obtenção dos fragmentos de DNA serve para criar, in vitro (em tubo de ensaio ou no laboratório),

novas moléculas, recortando e colando vários pedaços de informações.

Uma das primeiras enzimas de restrição a ser isolada foi a EcoRI, produzida pela bactéria Escherichia coli.

Essa enzima reconhece apenas a sequência GAATTC e atua sempre entre o G e o primeiro A.

O local do “corte”, o local de uma enzima, é conhecido como sítio alvo.

Você pode perguntar por que essa enzima não atua no DNA da própria bactéria?

Isso não ocorre devido à existência de outras enzimas protetoras, que impedem a ação das enzimas de restrição no material genético da bactéria.

As enzimas de restrição reconhecem e atuam sobre sequências específicas de DNA,

catalisando a destruição de uma ligação fosfodiéster entre dois nucleotídeos consecutivos ligados a determinadas bases.

Os nucleotídeos entre os quais a enzima corta, ou seja, entre os quais promove a hidrólise,

encontram-se no interior dessas mesmas sequências específicas de reconhecimento (ver imagem).

Cada molécula de DNA pode ser composta de várias repetições da sequência GAATTC ao longo de toda sua extensão.

Portanto ao contato com a enzima EcoRI a fita de DNA pode ser clivada "cortada" em diversos lugares, gerando vários pedaços, de tamanhos diferentes.

Separando fragmentos de DNA: eletroforese em gel

Os fragmentos de DNA formados com a ação das enzimas de restrição possuem tamanhos diferentes.

A técnica de separação dos fragmentos de DNA mais utilizada é a eletroforese através de géis de agarose.

A agarose é um polissacarídeo (como ágar e pectina) que dissolve em água fervente e então gelifica quando esfria como a gelatina.

Para realizar uma eletroforese, um gel de agarose é preparado,

o DNA é introduzido em pequenos poços de gel, e então uma corrente elétrica é aplicada através do gel.

Como o DNA é negativamente carregado, ele é atraído pelo eletrodo positivo.

Entretanto, para chegar ao eletrodo positivo, o DNA deve migrar através do gel de agarose.

Os fragmentos de DNA menores podem migrar através de um gel de agarose mais rapidamente que os fragmentos de DNA maiores.

É possível calcular o tamanho exato de um dado fragmento com base na sua razão de migração.

Após a eletroforese em gel, os fragmentos de DNA normalmente são corados com brometo de eteídeo,

que possui afinidade pelo DNA e fluorece (torna-se visível) vivamente em contato com a luz ultravioleta.

Dessa forma pode-se localizar as bandas que correspondem ao DNA.

Os fragmentos de DNA podem, então, ser isolados e purificados a partir dos géis de agarose.

A multiplicação dos fragmentos de DNA

Ocorrendo a fragmentação das moléculas de DNA,

com o uso das enzimas de restrição,

e o seu reconhecimento pela técnica de eletroforese em gel, o próximo passo é multiplicar

clonar o fragmento obtido e submetê-los à tecnologia do DNA recombinante.

A técnica de multiplicação da fita de DNA é chamada de PCR (reação em cadeia da polimerase).

Na década de 1980, passou-se a utilizar a técnica do PCR para fazer milhares de cópias de um único pedaço de DNA.

Essa técnica é usada em tubos de ensaio contendo o DNA e mais alguns compostos necessários,

como primers (DNAs iniciadores) e a enzima DNA polimerase (enzima que faz a duplicação do DNA).

Os primers são fitas de DNA, com mais ou menos 20 bases (A, T, C, G) complementares, isto é,

se ligam por complementaridade ao início da sequência de DNA que se quer multiplicar.

Quando uma molécula de DNA vai ser multiplicada deve-se separar a dupla fita,

formando assim duas fitas diferentes mas complementares entre si.

Cada fita servirá de molde para a duplicação, por isso, precisamos de dois tipos de primers diferentes (veja a figura).

Técnica do PCR passo a passo

Obtém-se uma amostra mínima de DNA de uma célula humana.

A amostra de DNA, a enzima que faz a replicação (DNA polimerase), os nucleotídeos de DNA e os primers complementares a sequência de DNA são colocados em um tubo de ensaio.

Coloca-se o tubo de ensaio em uma máquina de PCR (máquina que aumenta e diminui a temperatura de acordo com um programa).

Os passos seguintes, de aquecimento e resfriamento, acontecem dentro da máquina controlados pelo programa.

Aquece-se o tubo a 94ºC para desnaturar (separar a dupla fita) o DNA.

Cada fita simples do DNA que foi desnaturado serve de molde para a síntese de novas cadeias complementares.

Para isso resfria-se a 54ºC onde os primers se anelam ao início das duas fitas simples, servindo de iniciadores para a enzima polimerase.

Aquece-se novamente o tubo a 72ºC (temperatura ideal de funcionamento da DNA polimerase) para a duplicação da fita.

A DNA polimerase inicia, após o final do primer, a colocar os nucleotídeos livres na fita de DNA ligando-os por complementaridade, formando assim uma nova fita dupla.

A tecnologia do DNA recombinante

Cada fragmento de DNA, que foi clivado e separado do resto do material genético, contém um ou mais genes.

Lembre-se que cada gene origina uma proteína, portanto ao estudarmos o gene estamos estudando a proteína que ele codifica.

Mas o que devemos fazer para estudar o gene?

Devemos introduzi-lo no material genético (no DNA) de um hospedeiro para que ocorra a transcrição do gene, em RNAm, e a tradução em proteína.

O hospedeiro é um organismo que se multiplica (se reproduz) rapidamente, como por exemplo, as bactérias.

Quando as bactérias se reproduzem por bipartição elas transmitem ao seus “filhos” o seu material genético,

portanto se neste material conter o fragmento de DNA de estudo, em pouco tempo teremos milhões de bactérias com o gene.

O plasmídio é o material genético circular não ligado ao cromossomo que fica espalhado pelo hialoplasma das bactérias.

Ele sofre o mesmo processo do DNA cromossomal de transcrição e tradução, além de, se multiplicar a cada divisão celular, passando uma cópia para cada célula “filha”.

O plasmídio é retirado das células bacterianas para que se possa inserir o gene de estudo, para depois recolocá-lo na bactéria.

Para entendermos melhor vamos conhecer esse processo passo a passo (acompanhe na figura):

Os pesquisadores querem estudar um gene humano que produz uma proteína que não se sabe a função.

Os pesquisadores “recortam” (utilizando enzimas de restrição), do DNA humano, o gene de interesse.

Esse fragmento de DNA contendo o gene é multiplicado por PCR para obtermos várias cópias do mesmo fragmento (ou da mesma informação).

A mesma enzima que clivou o gene do DNA humano é utilizada para clivar o plasmídio bacteriano.

Lembre-se que o fragmento de DNA, ao ser clivado, gera pontas adesivas que são complementares ao plasmídio se este for clivado com a mesma enzima.

A seguir o plasmídio clivado é misturado com os fragmentos de DNA (contendo o gene)

e uma enzima chamada ligase “cola” os fragmentos ao plasmídio, produzindo o chamado DNA recombinante.

Isso feito, o DNA recombinante é introduzido em uma bactéria hospedeira.

A bactéria hospedeira é colocada em um meio nutritivo seletivo,

apenas aquelas que possuem o DNA recombinante crescem, formando colônias.

Após muitas gerações de bactérias,

o produto da expressão dos genes,

as proteínas humanas,

são purificadas das bactérias (são separadas das proteínas das bactérias).

Esse método produz uma grande quantidade de proteínas humanas possibilitando assim, seu estudo.

EXTRAÍDO DO SITE SÓ BIOLOGIA